1、柱壓?jiǎn)栴}柱壓?jiǎn)栴}是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。

1.1 壓力過高：

這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。

(1) 首先斷開真空泵的入口處，此時(shí)，PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果，液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。

處理方法：

用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，再檢查；

(2) 打開Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。

處理方法：

將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI(6.7Bar)以下，過濾白頭正常，再檢查；

(3) 把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。

處理方法：

如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。

假如，按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但是，一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以，盡量少用。

1.2 壓力過低

壓力過低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏

處理方法：

尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。當(dāng)然，還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸上液體。

處理方法：

打開Purge閥，用3～5mL/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

2、漂移問題主要包括基線漂移和保留時(shí)間漂移。

2.1 基線漂移

一般說來，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要半個(gè)小時(shí)的平衡時(shí)間，如果，你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(zhǎng)下(220nm)平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng)，但是，如果你在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：

① 紫外燈能量不足。

解決方法：

更換新的紫外燈；

② 柱溫波動(dòng)。

解決方法：

控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。

③ 流通池被污染或有氣體。

解決方法：

用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池(最好斷開柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。

④ 流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。

解決方法：

檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑。

⑤ 樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高K'值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而，表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。

解決方法：

使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

⑥ 檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。

解決方法：

將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處；

⑦ 流動(dòng)相的pH值沒有調(diào)節(jié)好。

解決方法：

加適量的酸或堿調(diào)至最佳pH值；

2.2 保留時(shí)間漂移

保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過15s，超過了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：

① 溫控不當(dāng)。

解決方法：

調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。

② 流動(dòng)相比例變化。

解決方法：

檢查四元泵的比例閥是否有故障。

③ 色譜柱沒有平衡。

解決方法：

在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。

④ 流速變化。

解決方法：

重新設(shè)定流速。

⑤ 泵中有氣泡。

解決方法：

從泵中除去氣泡。

2.3 峰型異常問題

峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對(duì)于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對(duì)待，從主要問題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。

① 所有峰均為寬峰。

解決方法：

系統(tǒng)未達(dá)到平衡；

溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；

色譜柱尺寸及類型選擇不正確；

色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低；

溫度變化造成的影響。

② 所出峰比預(yù)想的小。

解決方法：

樣品黏度過大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測(cè)器設(shè)置不正確，定量環(huán)體積不正確；檢測(cè)池污染；檢測(cè)器燈出現(xiàn)問題。

③ 色譜圖中未出峰。

解決方法：

系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解；

泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確；

檢測(cè)器設(shè)置不正確；

針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。。。

④ 一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰。

解決方法：

流動(dòng)相吸收本底高；進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。

⑤ 所有峰均為負(fù)峰。

解決方法：

信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒；

光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。

⑥ 出現(xiàn)雙峰或肩峰。

解決方法：

進(jìn)樣量過大；樣品濃度過高；

保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；

保護(hù)拄或色譜柱污染或失效；

柱塌陷或形成短通道。

⑦ 前伸峰。

解決方法：

進(jìn)樣量或樣品濃度高；

溶解樣品的溶劑較流動(dòng)。